目的是揭示与荷斯坦奶牛子宫炎相关的围产期免疫和代谢变化。荷斯坦奶牛 (n = 128) 在相对于分娩 (DRP) 的 -14、0、3 和 7 天时采集血液。流式细胞术用于评估血白细胞计数、比例和活化。总细胞、活细胞、单细胞、单核细胞 (CD172α+/CD14+)、多形核细胞 (CD172α+/CD14-/SSChigh)、B 细胞 (CD21+/MHCII+)、CD4+ T 细胞 (CD4+)、CD8+ T 细胞 (对 CD8+) 和 γδ T 细胞 (γδTCR+) 进行了评估。 CD62L 和 CD11b 均用作细胞活化标记。主要组织相容性复合体 II 类被用作单核细胞中抗原呈递的标记。使用 Milliplex 牛细胞因子/趋化因子 08-plex 试剂盒评估 IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10 和肿瘤坏死因子的血浆浓度 - α。使用非靶向气相色谱法和飞行时间质谱法在 -14 和 0 DRP 下测量血浆脂肪酸 (FA)。通过方差分析对数据进行重复测量分析。患有子宫炎的奶牛 (n = 57) 具有较高的产前体重、产前体重损失和产犊时较高的 FA 浓度。产犊时血浆FA与IL-1β呈正相关。患有子宫炎的奶牛具有持续的全身炎症，这通过产前和产后更大的 B 细胞激活、更高的促炎细胞因子浓度以及更大的细胞损伤来证明。产后，我们观察到多形核细胞活化和外渗较多，但单核细胞和 CD4+ T 细胞活化和外渗较少，这表明产后免疫耐受。患有子宫炎的奶牛产前肥胖程度较高，可能会导致产前和产后全身炎症和产后免疫耐受，这可能导致无法预防细菌感染和产后子宫炎的发生。

       子宫炎是荷斯坦奶牛产后不久的一种非常流行的疾病（Sheldon 等人，2006 年），给奶牛行业造成严重的经济损失（Pérez-Báez 等人，2021 年）。子宫炎的特点是子宫微生物群失调，其中致病菌超过子宫共生菌（Jeon 等人，2015；Jeon 等人，2016；Galvão 等人，2019）。致病细菌是否繁殖并引起子宫炎很可能取决于免疫系统对入侵病原体的反应效率。病原体识别后，子宫内膜细胞和驻留巨噬细胞产生促炎细胞因子，例如 IL-6 和 IL-8，导致白细胞大量涌入子宫腔，特别是中性粒细胞和单核细胞（Singh 等，2008；Galvão）等，2012；Sheldon 等，2014），负责细菌清除（Auffray 等，2009）。

       中性粒细胞和单核细胞从外周血聚集到炎症部位是由白细胞表面表达的细胞粘附分子和局部血管内皮细胞（例如 CD62L 和 CD11b）介导的（Ley，2003；Nourshargh 和 Alon，2014） 。此外，子宫内膜抗原呈递细胞，如单核细胞、树突状细胞和 B 细胞，吸收抗原，移动到区域淋巴结，并在主要组织相容性复合物分子的背景下呈递经过加工的抗原，以启动启动 T 辅助细胞（Swain等人，1991）。启动后的 T 辅助细胞会分泌促炎细胞因子，例如 IL-4，以激活 T 细胞和 B 细胞并诱导区域淋巴结增殖（Swain 等，1991）。激活的 T 细胞和 B 细胞会脱落 CD62L，驱使激活的淋巴细胞远离淋巴器官并流向发炎组织 (Ivetic et al., 2019)。当这种炎症反应发挥最佳作用时，会导致病原体清除和炎症消退（Chen et al., 2017）。

       尽管如此，当奶牛进入泌乳期时，免疫系统和病原体之间就会发生拉锯战，多项研究报告称，患子宫炎的奶牛在围产期间采食量减少，体重损失更大，循环脂肪酸和酮体积累更多（Hammon 等，2006；Chebel 等，2018）。这些迹象与白细胞功能受损有关，例如单核细胞产生的细胞因子减少（Galvão 等，2012）以及中性粒细胞吞噬作用和杀伤能力受损（Hammon 等，2006；Grinberg 等，2008；Ster 等，2012）。此外，与体况良好和体况不足的奶牛相比，体况过肥的奶牛在产前期的体重损失更大（Chebel 等人，2018）。据报道，真胃移位的奶牛在能量负平衡状态下的脂肪组织中出现了冠状结构（Contreras 等人，2015），因此，奶牛可能会出现类似的炎症状态，这可能会使奶牛容易患上子宫炎。

       在此，我们探索了围产期的代谢和免疫特征，试图揭示与急性产后子宫感染相关的免疫和代谢变化。

       我们观察到，与未患子宫炎的奶牛相比，患子宫炎的奶牛具有更大的 ppBW、产前和产后更多的激活的 B 细胞以及产前和产后更多的细胞死亡。在奶牛中，BW 与 BCS 密切相关，BCS 是脂肪组织沉积的衡量标准（Holling 等人，2004 年）；因此，我们推测更重的奶牛更胖。在非反刍动物中，坏死样脂肪细胞死亡是肥胖的病理标志（Cinti 等，2005）。在细胞应激或损伤时，受损或垂死的细胞会释放 DA 并通过不同途径激活免疫细胞，包括 Toll 样受体 (TLR) 刺激（Roh 和 Sohn，2018；Gong 等，2020）。肥胖期间，垂死的脂肪细胞会释放游离 DNA，该 DNA 到达外周血并作为 TLR-9 的内源配体（Guillerey 等人，2012）。在小鼠模型中，TLR-9 刺激 B 细胞会导致 CD62L 快速脱落，从而导致 B 细胞激活 (Morrison et al., 2010)。此外，活化的 B 细胞表达高水平的 CD11b，这增强了它们的迁移能力 (Kawai et al., 2005)。激活的 B 细胞浸润脂肪组织，并与 T 细胞和 M1 巨噬细胞一起以所谓的“冠状结构”包围坏死的脂肪细胞，从而导致局部和全身持续的低度炎症（Winer 等，2014）。肥胖期间脂肪细胞中脂肪酸积累水平较高，会激活 NADPH 氧化酶，从而增强活性氧 (ROS) 的产生及其向循环系统的释放（Furukawa 等，2004）。 ROS 升高会上调 NADPH 氧化酶的 mRNA 表达，增加 ROS 的产生，导致全身氧化应激，其特征是细胞死亡（Furukawa 等，2004）。

       在产前期间，我们观察到，与未患子宫炎的奶牛相比，患子宫炎的奶牛具有更高比例的 PMN 和单核细胞，以及更高的 IL-8 浓度。此外，我们观察到随着细胞死亡的增加，IL-8水平也增加，并且IL-8与PMN的比例呈正相关。细胞损伤相关的 OS 触发外周血白细胞产生 IL-8，刺激中性粒细胞从骨髓迁移到外周血 (Mulder et al., 2021)，并触发血管产生 C-C 基序配体 2 (CCL2)细胞，刺激单核细胞从骨髓迁移到外周血（Camps et al., 2014）。较高的 ppBW 以及较高的 B 细胞活化、较少比例的活细胞、较高的 IL-8 以及较高比例的 PMN 和单核细胞表明，将患子宫炎的奶牛在产前阶段正在经历全身性低度炎症。

       与未患子宫炎的奶牛相比，患子宫炎的奶牛产前体重减轻更多，产犊时脂肪酸更多，IL-1β和IFN-γ浓度更高。此外，我们观察到较重的奶牛产前体重减轻较多，血液脂肪酸较多，并且血液脂肪酸与细胞死亡和 IL-1β 浓度呈正相关。肥胖奶牛的脂肪细胞比非肥胖奶牛的脂肪细胞产生更多的瘦素（Kuhla 等人，2016）。瘦素被分泌到循环系统中，并被位于下丘脑弓状核的神经元感知，导致采食量减少（Ahima 和 Antwi，2008）。尽管大多数奶牛在分娩前后采食量减少，但患有子宫炎的奶牛在产前最后几周的采食量减少幅度更大，这导致脂肪酸动员更多（Hammon 等人，2006 年；Pérez-Báez 等人，2019 年） 。因此，这种过度的脂肪酸动员增强了 ROS 的产生（Schönfeld 和 Wojtczak，2008），加剧了持续的全身炎症反应。全身炎症的特点是外周血促炎细胞因子增多，例如 IL-1β，下丘脑弓状核中的神经元也能感知到这种细胞因子，从而加剧采食量的下降 (Kuhla, 2020)。最重要的是，坏死脂肪细胞周围的脂肪组织 T 细胞会产生高水平的 IFN-γ (Rocha et al., 2008)，从而增强脂肪分解 (Memon et al., 1992)，加剧脂肪酸动员，导致恶性脂肪代谢。细胞损伤、免疫细胞激活和细胞因子分泌、采食量抑制和脂肪分解的循环。事实上，活细胞比例的减少和 B 细胞的活化在分娩时持续存在，再加上 IL-1β 和 IFN-γ 水平较高，表明将患子宫炎的奶牛正在经历持续的炎症状态到产犊那天。

       在目前的研究中，患子宫炎的产后奶牛的单核细胞活化程度较低，MHCII 较少，计数较多，这表明单核细胞活化和外渗较少。相反，患有子宫炎的奶牛的 PMN 激活程度更高，并且 PMN 计数急剧下降，这表明 PMN 外渗更多。因为关于 CD62L 对 PMN 外渗作用的文献是矛盾的 (Swain et al., 1998; Momose et al., 1999; Diez-Fraile et al., 2002; Diez-Fraile et al., 2003; Ivetic, 2018; Björkman 等人，2019），我们研究了 PMN 计数与 PMN 上 CD62L 的 MFI 之间的相关性。观察到的 PMN 计数与 PMN 上 CD62L 的 MFI 之间的负相关性表明，PMN 在离开血管之前增加了 CD62L 的表达。

       众所周知，长期炎症反应会导致免疫耐受（Rogovskii，2020）。这种难治状态尤其与单核细胞和巨噬细胞反应受损（Fernández-Ruiz 等，2014）以及中性粒细胞向感染部位迁移的增强相关（Ariga 等，2014）。事实上，预先暴露于 DAMP 的人外周血单核细胞在 LPS 攻击后细胞因子的产生受损，这表明单核细胞暴露于 DAMP 会引起免疫耐受，导致单核细胞对后续刺激产生抵抗（Fernández-Ruiz 等，2014）。事实上，我们观察到，患有子宫炎的奶牛的单核细胞在大肠杆菌刺激后促炎反应降低（Galvão 等，2012）。因此，患有子宫炎的奶牛可能正在经历某种程度的免疫耐受，因此它们的单核细胞在外周血中积聚，并且它们的PMN被招募到子宫中。

       到达炎症部位后，PMN 释放颗粒蛋白，例如 azurocidin 和 catepsin 3，它们对单核细胞发挥趋化活性，使其外渗并募集到炎症部位（Soehnlein 等，2009）。尽管如此，已明确患有子宫炎的奶牛的中性粒细胞的吞噬作用和杀菌活性较低（Hammon 等，2006；Alhussien 等，2021）。因此，其他中性粒细胞功能（例如颗粒蛋白分泌）可能会受到损害，从而减少单核细胞向子宫的募集并导致其在血液中积聚。据我们所知，单核细胞是否由于免疫耐受或中性粒细胞损伤而没有被激活和招募来对抗子宫病原体目前尚不清楚，值得进一步研究。尽管如此，在到达组织后，单核细胞的主要作用是补充组织巨噬细胞（Auffray 等，2009）。由于专业的吞噬细胞、单核细胞和巨噬细胞协调清除入侵的病原体、凋亡细胞和死亡的中性粒细胞，在炎症的消退中发挥着关键作用（Parihar et al., 2010）。因此，我们假设患有子宫炎的奶牛的这一过程受到损害，从而影响了炎症过程的消退。

       此外，我们观察到，与未患子宫炎的奶牛相比，患子宫炎的奶牛产后 CD4+ T 细胞活化程度较低。到达子宫的 MHCII 表达较少的较少单核细胞可能会导致淋巴结处 CD4+ T 细胞的抗原呈递减少，导致外周血初始 CD4+ T 细胞比例增加，从而驱赶淋巴细胞的运输从子宫到淋巴器官（Ivetic et al., 2019）。一旦激活的 CD4+ T 细胞到达感染部位，它们就会针对致病病原体提供有益的免疫反应（Goswami 和 Awasthi，2020）。因此，CD4+ T 细胞募集的减少也会损害病原体的清除。

       患有子宫炎的奶牛在分娩后总细胞计数较少，这很可能是由于 PMN 计数急剧下降所致。鉴于患有子宫炎的奶牛在分娩后总细胞计数较少，它们的单细胞也较少。当观察活细胞中单细胞的比例时；然而，患有子宫炎的奶牛的单细胞比例更高。激活后，白细胞会增加粘附分子的表达，这使它们不仅能够与内皮细胞相互作用，而且能够与其他免疫细胞相互作用和粘附（Golias et al., 2011）。因此，由于患有子宫炎的奶牛的单核细胞和 CD4+ T 细胞的粘附分子表达较少，这些细胞彼此之间以及与其他免疫细胞之间没有相互作用，因此导致单细胞比例较高，这似乎是合理的。